人工培育肉灵芝浸出液的有效成分及毒性研究
分类号：R285 研究生学号：201534E026
人工培育肉灵芝浸出液的有效成分及毒性研究
Study on the effective components and toxicity of artificial
cultivation of Ganoderma lucidum
作者姓名：赵世凌
类别：工程硕士领域（方向）：生物工程指导教师：王丽萍教授培养单位：生命科学学院
2018年6月
人工培育肉灵芝浸出液的有效成分及毒性研究
Study on the effective components and toxicity of artificial
cultivation of Ganoderma lucidum
作者姓名：赵世凌
领域（方向）:生物工程
指导教师：王丽萍教授
学位类别：工程硕士
答辩日期：2018年05月25日
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学位论文作髀名:久 任 凌
日期：2018年4月7日
本论文对人工培育肉灵芝的有效成分蛋白质、核酸、多糖、维生素C和E、毗咯喳嚇醍(PQQ)及游离氨基酸进行分析及含量测定，用BCA法测定肉灵芝原液蛋白含量为8.14±0.42mg/ml,用0.22pm孔径滤膜过滤的肉灵芝浸出液蛋白质含量为5.11±0.78mg/ml,蛋白滤除率为37.22%；用定磷法测定核酸的含量实验中，分别测定人工培育肉灵芝双蒸水稀释为3%及肉灵芝原液(100%)无机磷、总磷含量。3%无机磷、3%总磷的含量分别48.1卩g/ml, 81.6卩g/ml。计算有机磷的含量为33.51ng/mlo人工培育的肉灵芝中核酸的含量为372.28卩g/ml。苯酚-硫酸法测定肉灵芝浸出液的多糖含量为2,623.71±531.63pg/ml；显色反应测定人工培育肉灵芝原液中维生素C含量为92.89卩g/ml；维生素E含量为8.52卩g/ml。用NBT-Gly法测定人工培育肉灵芝中卩比咯哇嚇醍(PQQ)含量为67.04±7.18卩g/ml。比色法测定人工培育肉灵芝中游离氨基酸含量的含量为39.87gmol/mL
在ICR小鼠灌胃人工培育肉灵芝浸出液的急性毒性试验中，分别对雄性和雌性小鼠进行灌胃给药(给药组：肉灵芝发酵液；Control组：蒸馅水；每组10只)，0.8ml/次/8h,每天给药3次，共观察14天，并记录动物的死亡时间、死亡只数与死亡时的状态，对死亡动物立即解剖，分析动物死亡原因。雄性小鼠：给药组小鼠给药后部分动物出现不同程度的呼吸急促、抽搐等症状，第二次给药后有两只抽搐死亡。在后续观察的Id到14d内，存活下来的动物部分状态好转，部分死亡。给药组共死亡5只，Control组无死亡。雌性小鼠：给药组小鼠给药后部分动物出现不同程度的呼吸急促、抽搐等症状，灌胃后第二天早晨有1只死亡。在后续观察的Id到14d内，存活下来的动物大部分状态好转偶有死亡。给药组共死亡2只，Control组无死亡。毒性实验表明肉灵芝发酵液有较大的性别差异，对小鼠的毒性很小。
本文对人工培育肉灵芝浸出液中有效成分及含量进行测定并通过ICR小鼠极毒实验证明该浸出液中营养成分丰富，且毒性作用低，可进一步用于保健品的开发及利用。
关键词：肉灵芝PQQ ICR小鼠毒性
Abstract
In this paper, the effective components of the artificial cultivation of Ganoderma lucidum which are protein, nucleic acid, polysaccharide, vitamin C and E, pyrroloquinoline quinone (PQQ) and free amino acids were measured. The total protein of Ganoderma lucidum was 8.14±0.42mg/ml by the BCA method, while the protein filtrate content was 37.22% by 0.22(im aperture membrane. The inorganic- and total-phosphorus contents also evaluated by fixed phosphorus method, 48.1|ig/ml and 81.6(ig/ml in 3% and pure artificial Ganoderma lucidum^ respectively. The content of nucleic acid, polysaccharides, vitamin C and vitamin E was 372.28 |xg/ml, 2,623.71 ± 531.63卩g/ml, 92.89g/ml and 8.52g/ml, respectively. And the content of pyrrolidone quinoline quinone (PQQ) was 67.04±7.18|ig/ml which was assessed by NBT-Gly method. The free amino acids content of Ganoderma lucidum was 39.87卩mol/ml evaluated by colorimetric method.
The acute toxicity effects of Ganoderma lucidum was evaluated in ICR mice (male and female). Ten male and female mice were treated with Ganoderma lucidum and distilled water by intragastric administration, per group at 3 times daily until 14 days. The death time, number and death state were recorded for researching the death reasons. For male mice: some with different degrees of respiratory shortness, twitching and other symptoms after administrating. Two of them dead after the second administration, and others alive. For female mice: some one with different degrees of respiratory shortness, convulsion and other symptoms after the first administration while one dead after the second gavaging with Ganoderma lucidum. In total, there were five male and two female mice dead in treated group, and none of one in cotrol group. The results reflected that the low toxicity effects of Ganoderma lucidum in ICR mice.
In summary, the results demonstrated that the variety of effective ingredients and contents, and the low toxicity of artificial Ganoderma lucidum in ICR mice.
Ganoderma lucidum could be further applied to the health products.
Key words:
Ganoderma lucidum PQQ ICR mice toxicity
1.1 肉灵芝1
1.1.2肉灵芝的分类1
1.1.3 肉灵芝的有效成分1
1.3 肉灵芝的功效研究2
2.2.1BCA法测定蛋白浓度6
2.2.6NBT-Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯哇嚇醒(PQQ)
3.2定磷法测定人工培育的肉灵芝中核酸的含量12
3.3苯酚-硫酸法测人工培育的肉灵芝中多糖含量13
3.4显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素C含量13
3.5显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量14
3.6 NBT-Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯喳嚇醍（PQQ）含
量14
3.7比色法测定人工培育的肉灵芝中游离氨基酸含量15
第二部分ICR小鼠灌胃人工培育肉灵芝浸出液的急性毒性研究.18 第一章前言18
2.1 实验目的19
2.2 材料与方法19
2.3 实验动物19
2.4.2 毒性评估实验20
第三章实验结果21
3.1给药剂量探究实验21
3.2.4各组动物死亡情况23
致谢29
第一章前言
1.1肉灵芝
1.1.1肉灵芝的来源
太岁(Ganoderma lucidum) E,又称肉灵芝，是一种自然界非常稀有的“特 大型罕见粘菌复合体"，是介于原生生物与真菌之间的粘细菌，属于菌科生物，生命力极强，颜色及形状多变，既有原生生物的特点，也有真菌的特点，是动、植物生命的本源。可以细菌、酵母菌等微小生物为食，或以纤维素、几丁质、甲壳质为营养。其生长状态与C源、温度、pH值密切相关nW。
1.1.2肉灵芝的分类
肉灵芝⑶分纤维状和肉胶质两种，纤维质肉灵芝产于大山，无弹性，近灵 芝；肉胶质状产自大地，有弹性，有肉质纹理。太岁生长十分缓慢，一年只生 长5%,太岁一般并不直接食用，常用的饮用方法：需5两至1斤太岁，泡水5 倍，7天之后，饮用太岁浸泡液。
1.1.3肉灵芝的有效成分
肉灵芝约85%的成分为水，其肉体和液体中富含乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种菌类，富含有机绪、核酸、有机酸(乳酸、叶酸)、多糖类(葡萄糖、 果酸、蔗糖、半乳糖)、维生素B族、C、D、E及氨基酸、蛋白质等【a】。其营养成分丰富，同属药食同源，可食用、入药，奉为“本经上品"，功效为“久食, 轻身不老，延年神仙"。更有典籍记载，太岁性平，苦，无毒，具有补脾润肺， 补肾益肝等价值”山。
1.2毗咯哇卩林醍(PQQ)
毗咯哇嚇醍(pyrroloquinoline quinone,PQQ)112'141是细菌脱氢酶中甲醇脱氢酶
的酶，是种新型的类似水溶性B族维生素，在食物中的含量约为3.65-61.0ng/g。
其穿透力和免疫力极强，被称为“免疫之王”。PQQ具有极强的抗癌功能，被誉为“专杀恶性肿瘤的导弹”，“生物界和氏璧”：可促进人体生长、增强肝功能、改善记忆能力、双向调节自由基等功能卩”17］。
PQQ可促进作物生长。一些促植物生长菌能通过葡萄糖脱氢酶GDH-PQQ 全酶作用来溶解土壤中的有机磷，促进植物吸收；强化矿化解磷作用，增加土壤中磷酸盐可利用率，促进农作物的生长，增大作物产量卩8);
PQQ具有双向调节自由基功能卩9］,兼具抗氧化和促氧化双重功效。PQQ能避免细胞内氧化反应以及体外生物活性物质产生活性氧导致的细胞损伤，使细胞具有抗氧化的耐受性12% PQQ浓度低于10卩mol/L,以抗氧化为主，当其浓度大于50卩mol/L, PQQ表现出促氧化作用。因而，PQQ对于氧化压力诱导的细胞毒性、凋亡有一定程度的保护作用。此外，PQQ能抑制过氧亚硝酸盐的形成, 阻止SIN-1诱发的ATP枯竭，清除超氧阴离子来避免牛血清白蛋白被硝化，起到对神经细胞的保护作用DU； PQQ能阻止神经毒素6-羟基多巴胺 (6-hydroxydopamine hydrobromide, 6-OHDA)诱导的SH-SY5Y 细胞DNA 断裂以及细胞死亡，显现出神经保护剂的功效。PQQ还能显著抑制血浆甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白含量和乳酸脱氢酶活性的升高【22】，能抑制高能低蛋白饲料引起的血浆超氧化物歧化酶活性降低和丙二醛含量的升高，进而达到调控、改善生物体状态的功能【23-24］。
此外，PQQ对信号转导的调节与DNA修复功能；基因表达和蛋白质功能的调控；促生长和抗逆性方面都有关键的作用。
1.3肉灵芝的功效研究
据《神农本草经》记载：“肉灵芝，无毒、补中、益精气、增智慧，治胸中结，久服轻身不老"。《山海经》称之谓“视肉"、“聚肉”、“太岁”、"封”，乃古 代帝王养生佳肴【25】。
肉灵芝及其浸出液虽未被开发为药物用于疾病治疗，但在抗肿瘤、抗衰老、免疫调节领域，表现尤为突出〔26-281。其有效成分多糖类、维生素C, E、及PQQ 都具有良好的抗氧化、调节自身免疫功能的低下的作用，在抑制肿瘤发生、防癌、抗癌等方面也有显著的功效。喻凯教授课题组指出太岁能显著提高免疫低下小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异性免疫功能，脾脏指数，T淋巴细胞增殖，抗体形成细胞数量及巨噬细胞的吞噬能力升高。可促进巨噬细胞RAW264.7分泌IL-l、IL-12及NO,促进其吞噬能力的提高。徐凌川教授课题组指出肉灵芝浸出液、肉灵芝水煎液对S180肉瘤小鼠的抑瘤率为18.3%和13.1%,表明肉灵芝浸出液、肉灵芝水煎液对小鼠体内肿瘤有一定抑制作用。
研究表明，肉灵芝可以通过促进白细胞介素-2的等内源性抗癌物质的生成, 通过促进单核巨噬细胞的吞噬功能，通过提升人体的造血能力尤其是白细胞的 指标水平；肉灵芝的抗辐射功能能迅速增加骨髓造血功能，升高白细胞、血小 板，明显缓解化疗后的毒副作用；肉灵芝的免疫调节功能能提高细胞免疫和体 液免疫，调节体液酸碱度，有效防止肠胃损伤，增强抵抗力，增加体内SOD, 延缓细胞衰老。肉灵芝的有效成分多糖、多肽具有明显的抗衰老功效。由于肉灵芝可调节代谢平衡，促进核酸和蛋白质的合成，因而能能促使血清、肝脏和骨髓的核酸及蛋白质的生物合成，因此可以有效地抗病防衰老。灵芝多糖有显著地抑SOD活性，可显著清除机体产生的自由基，从而阻止自由基对机体的损伤，防止了脂体的过氧化，保护了细胞，延缓了细胞衰老。此外，灵芝多糖DEI】能显著促进细胞核内DNA合成能力，并可增加细胞的分裂代数，从而延缓了机体的衰老〔32-36］。
1.4实验研究目的及意义
肉灵芝作为一种天然菌科生物，富含丰富的蛋白质、核酸、维生素等营养物质，其食用及药用功效已经引起科研工作者的广泛关注，然而对于肉灵芝及其浸出液的开发及利用还受到其来源稀有、难得的限制，对于其食用性的评估还鲜有报道。因而本文以人工培育肉灵芝浸出液为研究材料，通过BCA法测定其浸出液的蛋白质含量，通过定磷法、苯酚-硫酸法、显色反应、NBT-Gly法及比色法分别测定其核酸、多糖、维生素C、维生素E、毗咯哇咻醍(PQQ)及游离氨基酸的含量，为其营养成分分析提供理论依据；并通过ICR小鼠毒性实验，探究人工培育肉灵芝浸出液的毒性，为人工培育肉灵芝的进一步开发及利用奠定基础。
第一部分人工培育肉灵芝浸出液的有效成分分析
第一章前言
本实验釆用BCA法〔37-3刃测定人工培育的肉灵芝中蛋白质含量；定磷法测定核酸的含量；苯酚-硫酸法测多糖含量；显色反应测定维生素C和E含量；NBT-Gly法测定毗咯哇嚇醍(PQQ)含量；比色法测定游离氨基酸含量。合理有效评估人工培育肉灵芝的有效成分及相关含量测定。
1、人工培育肉灵芝原液(100%)中，蛋白质含量可达8.14±0.42mg/ml,若用0.22卩m 孔径滤膜过滤，可除去37.22%的蛋白质；
2、定磷法测定核酸的含量实验中，确定肉灵芝原液(100%)中核酸含量为372.28|ig/mlo
3、苯酚■硫酸法测多糖含量实验中，确定人工培育肉灵芝中多糖含量为2,623.71±531.63 卩g/ml。
4、显色反应测定维生素C、E含量实验中，测定人工培育肉灵芝原液(100%) 中，维生素C含量为92.89|ig/ml；维生素E含量为8.52|ig/mlo
5、NBT-Gly法测定毗咯哇咻醍(PQQ)含量实验中，测定人工培育肉灵芝中PQQ 的含量为67.04±7.18pg/ml。
6、比色法测定人工培育肉灵芝中游离氨基酸含量的含量为39.87卩mol/ml。
第二章实验材料和方法
2.1实验材料（仪器和试剂）
2.1.2主要试剂
BCA, Na2CO3«H2O, Na2C4H4O6«2H2O, NaOH, NaHCCh, C卩SO5H2O, KH2PO4, H2SO4, Gly-KOH, NBT,牛血清白蛋白（BSA）,氯仿，浓硫酸，钥酸铉，抗坏血酸，氨水，苯酚，乙醇，葡聚糖，三氯乙酸，盐酸，冰醋酸，维生素E标准品，PQQ标准品，Gly标准品等。
2.1.3主要实验仪器
生化培养箱（哈尔滨东联电子技术公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；低速离心机（北京雷伯尔有限公司）；电热恒温水浴锅（河北黄骅航天仪器厂）；电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂）；电子分析天平（SHIMADZ 公司）；手动移液器（德国Eppendorf公司）；冰箱（BCD-139GY,韩国三星/ 中国海尔公司）；制冰机（SIM-R124,日本SANYO公司）；旋转蒸发仪（上海一科科技有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；2501 紫外可见光分光光度计；多功能酶标仪。
2.2实验方法
2.2.1 BCA法测定蛋白浓度
BCA（bicinchoninic acid）法测定蛋白浓度是在世界上常用的蛋白浓度检测方法之一。原理依据二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuret reaction），一价铜离子和独特的BCA Solution A （含有BCA）相互验标准；称取0.5g牛血清白蛋白配制成终浓度为5mg/ml的蛋白标准品储备液, 工作浓度为0.5mg/ml；实验测定波长为540-595nm,通过多功能酶标仪测定样品0D值，并绘制标准曲线、计算出样品的蛋白浓度。
2.2.2定磷法测定人工培育的肉灵芝中核酸的含量
核酸分子结构中含有一定比例的磷（RNA含磷量约为8.5%〜9.0%, DNA含磷量约为9.2%）,测定其含磷量即可求岀核酸的量。核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下，无机磷与钥酸铉结合形成黄色磷铜酸铉沉淀，其反应为：
POF-+3NH4-+I2MOO4 +24H-——► （NH^PO# +12Mo03-6H;0-6H;0
在还原剂存在的情况下，黄色物质变成蓝黑色，称为钳蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。
定磷法［404］测定核酸的含量参照碧云天生物技术有限公司（Beyotime Biotechnology）实验标准；分别配制标准磷溶液，17%硫酸，2.5%钥酸铉溶液, 10%抗坏血酸溶液（现用现配），5%氨水,27%硫酸。按比例添加各反应试剂，混合均匀后，45°C水浴lOmin,冷却至室温后，于660nm处测吸光度，绘制标准曲线。
总磷的测定：取2mg/ml核酸溶液1.0ml,加入2.5ml 27%硫酸及一粒玻璃珠，于通风橱内直火加热至溶液透明（切勿烧干），表示消化完成。冷却后取下，将消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸馅水洗涤试管两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混匀后吸取3ml溶液置试管中，加3ml定磷试剂，45°C水浴保温10min后取出，测A660-
无机磷的测定：配制0.02mg/ml核酸溶液，取3.0ml置试管中，加定磷试剂3.0ml, 45°C水浴中保温10min后取出，测A 660。
有机磷的测定=总磷A660-无机磷A660 （有机磷含量可根据标准曲线计算）样品中核酸含量测定：
2.2.3苯酚-硫酸法测人工培育的肉灵芝中多糖含量
多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。这种橙黄色化合物可以用比色法测定。
苯酚-硫酸法【42*1测定多糖含量参照碧云天生物技术有限公司（Beyotime Biotechnology ）实验标准；分别配制80%苯酚，6%苯酚，15%三氯乙酸（15%TCA） , 5%三氯乙酸（5%TCA） , 6mol/L氢氧化钠及6mol/L盐酸；配制40mg/L葡聚糖（或葡萄糖）溶液，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馅水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml, 摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
样品含量测定：lg样品Tlml 15%TCA溶液研磨-取上清液加适量5%TCA 溶液研磨（重复3次）一3000转/分钟离心15min （重复三次离心取上清）共收集18ml上清液-加入2毫升6mol/L盐酸，混匀-96°C水浴锅中水浴2小时-冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠，混匀-定容至25ml-取适量样品，蒸馄水稀释10倍至2.0ml—加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml—室温放置20分钟-490nm测光密度一根据标准曲线计算多糖含量。
2.2.4显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素C含量
三价铁离子与还原性抗坏血酸迅速作用生成二价铁离子，后者再与啡罗嚇显色反应，可以测定维生素C的含量|45加1。
显色反应测定维生素C含量参照碧云天生物技术有限公司（Beyotime Biotechnology）实验标准；配制6卩g/ml Vc标准品用于标准曲线绘制，用紫外可见光分光光度计测定波长536nm处吸光度值。
Vc含量的计算:
Vc含量g顷）=羸銘專銘x标准品浓度顷g/心样品前处理稀释倍数（4倍）
2.2.5显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量
Ve在菲啰咻的存在下，可使三价铁离子还原成二价铁离子，后者在特定的环境下可与菲啰卩林形成粉红色复合物，通过比色，在标准曲线上可査出Ve的含量，或通过公式可计算出Ve的含量。
显色反应测定维生素E含量参照碧云天生物技术有限公司（Beyotime Biotechnology）实验标准；配制12jig/ml Ve标准品用于标准曲线绘制，用紫外可见光分光光度计测定波长533nm处吸光度值。
Ve含量的计算：
VE含量（ug/ml ）= W机0曜_蜜0曜 X标准品浓度（12ug/ml ）x样本测试前稀释倍数标准OD值一空白0D值
2.2.6 NBT-Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯喳嚇醍（PQQ）含量
在PQQ的结构式中有两个相邻的醛基（氧化型）时，可缩写成PQQ（O）2[47）o此物在碱性条件下，可氧化甘氨酸，而本身被还原即醛基被还原为经基（还原型）, 可缩写为PQQ（OH）2,与此同时产生的过氧化物的阴离子，可使NBT还原生成甲磨化合物（反应如下）：
NHz—CHz COO- \ f PQQ（OH）A f 2O；+2H+ , 1 NBT（还原型）
NH=CH—COO I \ PQQ（O）2 J \/ \ NBT（氧化型）
该化合物在530nm有最大消光值A,在规定条件下，其消光值A大小与PQQ含量高低成正比关系，因此，检测甲腊化合物在530nm的消光值即可推算出PQQ的含量。醒式氧化还原循环的效率依赖于醒的性质，在游离醒中，PQQ 催化此反应最有效。
NBT-Gly法测定毗咯哇嚇醍（PQQ）含量参照碧云天生物技术有限公司（Beyotime Biotechnology）实验标准；配制1 Opg/m 1 PQQ 标准液；NBT-Gly K 溶液[预先配制2 mol/LGly-KOH溶液（pH10）,使用时加入NBT（终浓度0.24 mmol/L].在96孔板中加入300 gL反应体系，包括20卩LPQQ、80卩LPBS、180卩LGly-KOH、20卩L NBT。30°C温箱避光作用1 h,酶标仪490nm检测前用
移液枪吹打使溶液均匀。用蒸馅水代替PQQ作为对照；检测样品时，用双蒸
水作为对照[48_49]o
2.2.7比色法测定人工培育的肉灵芝中游离氨基酸含量
铜离子（Cu2+）能与各种氨基酸络合产生蓝绿色的络合物，在一定波长下颜色的深浅与总氨基酸的含量成正比，故可以用可见光分光光度计测其吸光度, 通过换算得到总氨基酸的含量。
比色法测定游离氨基酸含量参照碧云天生物技术有限公司（Beyotime Biotechnology）实验标准；50mmol/L甘氨酸标准溶液用于标准曲线的绘制。实验样品反应完全后，3500转/分离心10分钟，取上清于650nm处测定吸光度值。
游离氨基酸测定公式:
2.3结果统计与分析
实验数据采用Excel结合GraphPad Prism5.01进行统计分析，以平均值土标准差（Mean土SD）表示。P<0.05, *表示显著差异，P<0.01, **表示极显著差异。
第M实蟀果
3.1 BCA法测定人工培育的肉灵芝中蛋白质含量
实验通过BCA法测定人工培育的肉灵芝中蛋白质含量，绘标准曲线y = 0.6062x +
0.0029, R2= 0.9962,标准曲线如图1所示。测定待测样品（过滤/未过滤太岁样品）的 蛋白质浓度值如表1-BCA法测定人工培育的肉灵芝中蛋白质含量所示。
实验结果表明：过滤的肉灵芝溶液中蛋白质含量随稀释比例逐渐升高，但较未过滤肉灵芝组有显著的降低。其中过滤组人工培育肉灵芝溶液的蛋白质含量为8.14±0.42mg/mL若用0.22呻孑L径滤膜过滤，可除去37.22%的蛋白质，表明人工培育肉灵芝溶液中存在大分子量蛋白质，在0.22孑L径滤膜中可部分过滤除去。
3.2定磷法测定人工培育的肉灵芝中核酸的含量
实验通过定磷法测定人工培育的肉灵芝中核酸的含量，绘制标准曲线y = 0.1552x + 0.0094, R2 = 0.9984，标准曲线如图2所示。测定待测样品的核酸含量如表2-定磷法测 定人工培育的肉灵芝中核酸的含量所示。
实验结果表明：通过定磷法测定人工培育的肉灵芝中核酸的含量，绘制标准曲线y
=0.1552X + 0.0094, R2 = 0.9984。并测定3%无机磷、3%总磷的含量分别48.1阐ml,
2.28pg/mlo
33苯酚•硫酸法测人工培育的肉灵芝中多糖含量
实验通过苯酚-硫酸法测人工培育的肉灵芝中维生素E含量，并计算待测样品的0D
值如表3-显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量所示。
表丄显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量
空白0D值标准0D值检测0D值
0.010.160.11
疇公式计算：
VE含量（ug/ml ） = OD . _ 营OD普、标准品浓度（12ug/ml ）X样本测试前稀释倍数标准OD值一空白OD值
经计算，确定人工培育的肉灵芝中维生素E含量为8.52pg/ml。
3.4显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素C含量
实验通过苯酚-硫酸法测人工培育的肉灵芝中维生素C含量,并计算待测样品的OD 值如表4•显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素C含量所示。
表4■显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素C含量
空白OD值 | 标准OD值 | 检测OD值 |
0.03 | 0.31 | 1.10 |
腆公式计算:
Vc含量（使"=鹭《嚣第旨囂 x标准品浓度（6〃g/湖）x样品前处理稀释倍数（4倍）
确定人工培育肉灵芝中维生素C的含量为92.89pg/ml。
3.5显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量
实验通过苯酚-硫酸法测人工培育的肉灵芝中维生素E含量，并计算待测样品的0D 值如表5-显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量所示。
表5■显色反应测定人工培育的肉灵芝中维生素E含量
空白0D值标准0D值检测0D值
0.010.160.11
鱒公式计算：
VE含量（ug/tnl ）= x标准品浓度（12ug/ml ）x样本测试前稀释倍数
标准OD值一空白OD值
确定人工培育的肉灵芝中维生素E含量为8.52ng/mlo
3.6 NBT-Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯哇嚇醍（PQQ）含量
实验通过NBT—Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯喳嚥昆（PQQ）含量，并测定、绘^标准曲线如图4NBT—Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯哇蜓昆（PQQ）含量。测定待测样品的OD值并计算含量，如表&NBT—Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯喳嚇昆（PQQ）
NBT-Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯卩奎嚇醍（PQQ）含量
表6>NBT—Gly法测定人工培育的肉灵芝中毗咯哇嚇醍（PQQ）含量
pg/ml | Optical Density | |
sample 1 | 1.51 | 0.29 |
sample? | 1.53 | 0.30 |
sample3 | 1.64 | 0.32 |
sample4 | 0.91 | 0.18 |
sample5 | 0.93 | 0.19 |
sample6 | 0.82 | 0.17 |
3.7比色法测定人工培育的肉灵芝中游离氨基酸含量
实验通过比色法测定人工培育的肉灵芝中游离氨基酸含量，并测定、绘^标准曲线
如图4比色法测定人工培育的肉灵芝中游离氨基酸含量。测定待测样品的OD值并计算含量，如表7-比色法测定人工培育的肉灵芝中游离氨基酸含量所示。
实验结果表明：samplel代表人工培育肉灵芝稀释至体积比为40%的0D值及含量值为29.8pmol/ml； sample2代表50pmol/ml标准品，经计算确定人工培育肉灵芝中游离氨基酸的含量为39.87呻ol/ml。对于指导人工培育肉灵芝的营养成分及含量有指导意义。
3.8小结
本项目釆用多种方法及手段测定了文献报道及未报道的肉灵芝中有效成分，主要针对人工培育肉灵芝的营养成分进行了测定，其中包括：蛋白质、核酸、多糖、维生素C、维生素E、PQQ以及游离氨基酸的含量。
实验釆用了多种方法对肉灵芝的有效成分进行了测定，包括：BCA法测定人工培育的肉灵芝中蛋白质含量；定磷法测定核酸的含量；苯酚-硫酸法测多糖 含量；显色反应测定维生素C和E含量；NBT-Gly法测定毗咯喳嚇醍(PQQ) 含量；比色法测定游离氨基酸含量。合理有效的评估人工培育肉灵芝的有效成分及相关含量。
实验确定过滤的肉灵芝溶液中蛋白质含量随稀释比例逐渐升高，但较未过滤肉灵芝组有显著的降低。过滤组人工培育肉灵芝溶液的蛋白质含量为8.14±0.42mg/ml,若用0.22pm孔径滤膜过滤，可除去37.22%的蛋白质，对于细胞实验中肉灵芝原液的处理有重要指导意义。人工培育的肉灵芝中核酸的含量为372.28卩g/ml；多糖含量为2,623.71±531.63pg/ml；维生素C的含量为92.89卩g/ml；维生素E含量为8.52卩g/ml； PQQ的含量为67.04±7.18ug/ml；游离氨基酸的含量为39.87卩mol/ml。
由以上数据可知，人工培育肉灵芝营养成分丰富，富含多种蛋白质、氨基酸及维生素，对于指导人工培育的肉灵芝的合理开发利用有重要的指导作用
第二部分ICR小鼠灌胃人工培育肉灵芝浸出液的
急性毒性研究
第一章前言
本实验选取ICR小鼠进行人工培育肉灵芝浸出液的急性毒性试验评估。实验分别对雄性和雌性小鼠进行灌胃肉灵芝发酵液试验。
给药剂量探究实验中，分别选取雄性、雌性小鼠各9只，随机分为3组，每组3只，给药组灌胃给药肉灵芝发酵液0.2ml、0.4ml； Control组不给药，观察小鼠的生存状态，并确定给药剂量。毒性评估实验中，分别选取雄性/雌性小鼠 各20只。雄性组随机分组2组，每组10只，给药组给肉灵芝发酵液0.8mKControl 组给蒸馅水0.8 ml, —天内每8小时灌胃给药一次,共给药3次，给药后观察14d, 并记录动物的死亡时间、死亡只数与死亡时的状态，对死亡动物立即解剖，分析动物死亡原因。雌性组分组及给药方式同雄性组。
在给药剂量探究实验中发现小鼠在灌胃给药0.2ml时无死亡，0.4ml时仅有一只雌性小鼠死亡，雌雄小鼠体重变化有差异，因此应按性别分雌、雄两组小鼠进行实验。
毒性评估实验中，雄性小鼠给药后部分动物出现不同程度的呼吸急促、抽搐等症状，第二次给药后有两只抽搐死亡。在后续观察的Id到14d内，存活下来的动物部分状态好转，部分死亡。给药组共死亡5只，Control组无死亡。雌性小鼠给药后部分动物出现不同程度的呼吸急促、抽搐等症状，灌胃后第二天早晨有1只死亡。在后续观察的Id到14d内，存活下来的动物大部分状态好转偶有死亡。给药组共死亡2只，Control组无死亡。
肉灵芝发酵液对ICR小鼠有较大的性别差异，对小鼠的毒性很小。
第W实验材料和方法
2.1实验目的
本实验釆用雌、雄性ICR小鼠分别进行肉灵芝发酵液灌胃给药機，旨在其毒性靶器官的毒性，阐明该药的急性毒性作用，评价药物的安全性，为药物的临床应用提供毒理学瞄
2.2材料与方法
人工培育肉灵芝浸出液购自白山市林源春生态科技有限公司（20164批次），其理化性愤莉色溶液，于4C保存，程中不能硼的剩余供试品留样，剩钏分直接进行废并i嗥。
23实验动物
ICR小鼠（SPF级）购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。实验动物为冬8周龄，体重18.Q22.0g ,雌雄各30只。生产许可证号：SCXK （吉）-2011-0004；动物质量合格踽号：201600015500o
^^5严跡照吉林大学生斜斗学学院^列进行管歟饲养。条 件 室温21.QW.9°C；相对湿度61.0*6.8%；光照明：暗=12h： 12h。笼具：每盒10只；饮食饮水：每日添加鼠专用饲阳共动物，灌装自来水；垫料：每隔一天更换。
动物适应过程：新领?啲动物适应期3天，期间动物饮水、摄食和健康状况正常。小鼠皮毛癇、鼬灵敏、无异常分泌精
W只别：对啾进彳腌笼卡出此笼动物的细0。
笼具标号：对动物饲养笼进行标记，并注明、供试品名称、浓度或^撞、组别。
笊曄囲购肉去：给药当天早询重，根据^^重按分层随机化笊且法
进行例。
2.4实验设计
2.4.1给药齐IJS探究实验
分别选取雄性、雌性小鼠各9只，随机分为3组，每组3只，给药组灌胃给药肉灵芝
0.2ml、0.4 ml； Control组木合药，观察小鼠的生験定给新!
2.4.2毒性谢古实验
分别选取雄阻雌性小鼠各20只。雄性组随机分组2组，每组10只，给药组给肉灵芝发酵液0.8ml、Control组给蒸饲水0.8 ml, —^内每8小时灌胃给药一次，共给药3次，给药后观察14d,并记录动^5的死亡时间、死亡只数与死亡时的状态，对死亡动物立即解剖，分^»亡原因。雌幽且wst合药方式同;且。
2.43实马鋤物观察
严密观察动物对供试品的反应。详细i嗥动物毒性5应情况：中毒症状、严重程度、中毒发生时间持续时间、恢复时间及动物死亡时间和死亡动物数，对于死亡动物及时进行大体解剖，药后每天观察一次，每隔3天称一次体重，持续观察14天。
体重测定：给药前，给药后龄14天，每3天测定体重1次。
解剖大体检查：中毒死亡的动物，解剖检查，判断脏器的毒性情况。
2-5结果统计与分析
所有体SW湖Excel统计软件进彳设计姆里分析。觴各纟腕亡动物数，分析药姗性。
第三章实验结果
3.1给药剂量探究实验
实验分别选取雄性、雌性小鼠各9只，随机分为3组，每组3只，给药组灌胃给药肉灵芝发酵液0.2ml、0.4 ml； Control组不给药，观察小鼠的生存状态, 并确定给药剂量。
实验结果：雌性小鼠：0.4ml给药组小鼠死亡一只；雄性小鼠：无死亡。经多次反复给药剂量探究实验摸索，最终确定该药物毒性较弱，且存在性别差异, 故在毒性评估实验中应针对雌性、雄性个体分别进行毒性评估。同时实验中严 格要求小鼠的日龄和体重在18-22g之间。
3.2毒性评估实验
3.2.1体重
观察期内测定体重结果表示体重增长正常。
3.2.2笼旁观察
检疫期内动物行为活动正常，无异常外观体征，粪便颜色、形状正常。
给药后给药组小鼠部分出现呼吸急促，抽搐等症状。两只雄性给药组小鼠第二次给药后迅速死亡。给药后两周内大部分状态恢复正常，部分死亡。
3.2.3大体解剖
对实验过程中出现死亡的ICR小鼠立即进行解剖，观察动物器官的病变情况。进而评估药物毒性。
对死亡动物进行解剖（图3.2）,观察ICR小鼠胃（A）,肠（B）及肺（C） 的病变情况，发现动物肺部边缘充血，其余脏器未发现异常。表明人工培育肉灵芝浸出液毒性较低，不会对动物器官造成明显的损伤。
3.2.4各组动物死亡情况
通过对毒性评估实验中ICR小鼠灌胃死亡情况进行统计，汇总如下表:
3.3小结
本实验选取ICR小鼠进行人工培育肉灵芝浸出液的急性毒性试验评估。实验分别对雄性和雌性小鼠进行灌胃肉灵芝发酵液试验。通过给药剂量探究实验，确定小鼠在灌胃给药0.2ml时无死亡，0.4ml时仅有一只雌性小鼠死亡，雌雄小鼠体重变化有差异，因此应按性别分雌、雄两组小鼠进行实验。
在毒性评估实验中，雌/雄小鼠给药0.8ml/次/8h,共给药观察14天，雌/雄小 鼠给药后部分动物出现不同程度的呼吸急促、抽搐等症状。雄性鼠第二次给药 后有两只抽搐死亡；雌性鼠灌胃后第二天早晨有1只死亡。在后续观察的Id到14d内，存活下来的雌/雄小鼠部分状态好转，部分死亡。雄性鼠给药组共死亡 5只，Control组无死亡。雌性鼠给药组共死亡2只，Control组无死亡。
实验结果表明肉灵芝发酵液对ICR小鼠有较大的性别差异，对小鼠的毒性作用较低。
总结
本论文对人工i咅育肉灵芝的有效成分蛋白质、核酸、多糖、维生素C和E、毗咯A瓣醍（PQQ）及游离氨基酸进行分析及含量测定，确定人工培育肉灵芝浸出液中蛋白含量为8.14iO.42mg/ml;有机磷的含量为33.51gg/ml；核酸的含量为372.28gg/ml；多糖含量为2,623.71±531.63pg/ml；维生素C含量为92.89pg/ml；维生素E含量为8.52gg/ml；毗咯哇嚥昆（PQQ）含量为67.04i7.18pg/ml；游离氨基酸含量的含量为39.87呻ol/ml。为人工培育肉灵芝的营养成分及功能开发奠定理论基础。
在ICR小鼠灌胃人工培育肉灵芝浸出液的急性毒性试验中，通过给药剂fi探究及毒性评估实验，确定人工培育肉灵芝发酵液对ICR小鼠有较大的性别差异，对小鼠的毒性很小。
综上所述，本文对人工培育肉灵芝浸出液中有效成分及含量进行测定并通过1CR小鼠极毒实验证明该浸出液中营养成分丰富，且毒性作用低，可进一用于保健品的开发及利用。
参考文献
[1] 李海月，黄继红，冯军伟,苏雪锋，王文，杨铭乾.太岁的研究进展[J].农产品加工,2015(11):73-75+77.
[2] 李曙光，周秀文，吴志红,李越中.粘细菌的种群生态及其生存策略[J].微生
物学通报,2013, 40 (01): 172-179.
[3] 聂鑫森. “太岁”到底是何方神圣[J].文史博览,2017(02):28.
[4] 佚文.为何“在太岁头上动土"就是造次[J].人才资源开发,2017(17):17.
[5] 巨峰.中药”肉灵芝”，中华医药，2018, 11:21.
[6] 戴璐.“大型黏菌复合体”黏菌和真菌多样性的初步研究[D].西北大
学,2007.
[7] 韩晓伟，张小波，严玉平，郑玉光，冯红，赵同安.高通量测序方法分析黄河太
岁细菌的多样.微生物学通报,2017(12): 1-9.
[8] 郑科研，董兆麟.不明物体“太岁”的初步研究[J].西北大学学报(自然科 学版)，2010, 40 (06): 1012-1016.
[9] 王禹.太岁的抑菌作用及对小鼠免疫功能影响的研究[D].西南交通大
学,2017.
[10] 军野.灵芝的有效成分及应用[N].世界报,2008-08-27(016).
[11] 孙树英，王洪存，张云，王磊.灵芝有效化学成分的研究[J].中国食用菌,1997(01) :8-11.
[12] 唐靓，张岭，李林子，王茵.毗咯哇咻醍研究新进展[J].食品科学,2015, 36(19): 287-291.
[13] 杨璐,熊向华，汪建华,张惟材.毗咯哇嚇醍研究进展[J].生物技术通
讯,2009, 20(06):874-879.
[14] 周怡雯，陈建华.新辅酶毗咯哇嚇醍研究进展[J].中国生化药物杂
志,2008(04): 279-282.
[15] 冷春玲，宋洁.毗咯哇咻醒生物学功能研究进展[J].辽东学院学报(自然科 学版),2014,21(02): 103-108.
[16] 王歆,张惟材.毗咯哇嚇醍生物合成研究进展[J].生物技术通讯,2007(03): 534-538.
[17] 唐靓，张岭，李林子，王茵.毗咯喳嚇醍研究新进展[J].食品科
学,2015, 36(19): 287-291
[18] 冷春玲，宋洁.毗咯哇嚇醍生物学功能研究进展[J].辽东学院学报(自然科
学版)，2014, 21 (02): 103-108.
[19] 胡文敏，李林子，张岭，张丽靖，陈建国，刘冬英，刘臻，胡志航，王茵.毗咯喳 嚇醍对高脂血症大鼠糖脂代谢肝功能及脂质过氧化影响的实验研究[J].中国预防医学杂志,2016, 17(01):23-27.
[20] 贺斌，刘世清,李皓桓.毗咯哇嚇醍对雪旺细胞增殖及NF- k B表达的影响
[J].中国矫形外科杂志,2009, 17(21):1647-1650.
[21] 贺斌,刘世清，李皓桓.Wnt/ B -catenin信号通路在毗咯喳咻醍促雪旺细胞增殖中的作用研究[J].中国矫形外科杂志,2010, 18(10):840-843.
[22] 张鹏，孙慧玲,孙静娴，杜阳，李淑英.毗咯喳哧醍(PQQ)营养作用研究进展[J].现代生物医学进展,2014, 14(10) : 1987-1990.
[23] 王歆,汪建华，刘党生,张惟材.毗咯哇嚇醍产生菌筛选方法建立及菌种筛 选[J].微生物学报，2007 (06) : 982-986.
[24] 王歆,张惟材.毗咯喳嚇醍生物合成研究进展[J].生物技术通
讯，2007(03): 534-538.
[25] 什么是“太岁” [J].福建农业,2007(01) :37.
[26] 李刚.太岁大将军的生命意义[J].宗教学研究,2006(02) :47-51.
[27] 白婷婷.“太岁”的生物学特性及部分基因组测量的研究[D].辽宁大
学,2011.
[28] 朱春玉，白婷婷,姜秋实，郑方亮,艾海新，朱俊丰,刘宏生.“太岁”生物学 组分的研究[J].微生物学杂志,2011, 31 (01): 1-5.
[29] 丁妍,周向毅，崔莉，陈海江，张勇妹,郭贵宾，孙锐，陈邦元.灵芝多糖对辐 射损伤小鼠的防护作用[〕].医学研究生学报,2014, 27(11): 1152-1155.
[30] 刘佳，王勇.灵芝多糖的研究进展[J].现代药物与临
床,2012,27(06): 629-634.
[31] 李晓冰，赵宏艳，郭栋.灵芝多糖药理学研究进展[J].中成
药,2012,34 (02): 332-335.
[32] 赵芹,张海军，武书庚,岳洪源，王晶，齐广海，孙琳琳.毗咯喳嚇醍对高能低 蛋白质饲粮蛋鸡生产性能、蛋品质、血浆脂质代谢及抗氧化能力的影响[J].动物营养学报，2014, 26 (04): 885-892.
[33] 王朝江，王世清.基于高通量测序技术对三种太岁样品细菌组成的分析[J]. 湖北农业科学,2017, 56(13): 2543-2547.
[34] 张鹏，孙慧玲,孙静娴，杜阳，李淑英.毗咯哇嚇醍(PQQ)营养作用研究进展
[J].现代生物医学进展,2014, 14 (10): 1987-1990.
[35] 孙丽敏，张海军，武书庚,岳洪源，王晶，齐广海.毗咯哇嚇醍二钠对蛋鸡生 产性能和鸡蛋胆固醇含量的影响[J] .动物营养学报,2014, 26 (09): 2565-2573.
[36] 杨延新，熊向华，游松，张惟材.3种检测毗咯哇哧醍的方法比较[J].生物技术通讯，2011, 22 (04): 544-547.
[37] 韩富亮，袁春龙，郭安鹊,张予林，李运奎.二喳咻甲酸法(BCA)分析蛋白多肽的原理、影响因素和优点[J].食品与发酵工业,2014, 40(11):202-207.
[38] 刘璇，冯志明.BCA法测定食品中的微量铜[J].食品科
学,2011,32(14):277-280.
[39] 左娟.BCA法测定大鼠肝微粒体中蛋白质浓度[A].中国人民解放军医学检验学会.第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C].中国人民解放军医学检验学会:,2005:2.
[40] 吴春敏，龚蜜.定磷法测定复方制剂中核酸含量[J].中国生化药物杂志，1997 (01): 44-45.
[41] 景桂兰，刘祖昌，李冬伟.核酸含量的测定[J].广东微量元素科
学,1999(11):48-49.
[42] 杨勇杰，姜瑞芝,陈英红，张萍，高其品.苯酚硫酸法测定杂多糖含量的研究 [J].中成药,2005 (06): 706-708.
[43] 姜琼，谢妤.苯酚-硫酸法测定多糖方法的改进[J].江苏农业科学,2013,41(12) :316-318.
[44] 黎晶晶，徐格非.苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的研究[J].杭州化工，2008 (01): 23-26.
[45] 时惠敏，胡春霞.基于Fe~(2+)的显色反应测定还原性药物的研究进展[J]. 广州化工，2015, 43(07): 39-41.
[46] 刘红，龙月蓉,唐黔生.硫氤酸钾法测定Fe、(3+)含量的显色反应条件试验[J].贵阳医学院学报,2003(05):456-459.
[47] 杨延新，熊向华，游松，张惟材.3种检测毗咯哇噂醍的方法比较[J].生物技术通讯,2011, 22 (04): 544-547.
[48] 刘英杰，李晓东.差式氧化数法一一计算有机物氧化还原当量的简捷方法[J].佳木斯医学院学报,1989(02) : 114-116+208-209.
[49] 一种湿式氧化还原脱硫工艺的再生系统及再生方法[J].石油化工，2015, 44 (04) :499.
作者简介
赵世凌，1999年毕业于大连医科大学。现为大连市第三人民医院麻醉科主任，主任医师。辽宁省医学会疼痛学会委员，中国心胸血管麻醉非心脏手术分会委员，辽宁省麻醉质量控制中心委员。
从事麻醉临床工作十余年，先后在复旦大学附属中山医院、中国人民解放军总医院、首都医科大学附属北京安贞医院、上海市第六人民医院进修、学习。医学基础扎实，熟练掌握各种麻醉操作技术，将可视化引导下的外周神经阻滞技术广泛应用于临床。擅长疑难、危重症病人的围术期麻醉管理。对有复杂合并症的各种专科麻醉管理，及危重患者的抢救、复苏有着丰富的临床经验。
致谢
三年的硕士学习生涯即将画上句号。在论文完成之际，我要衷心的感谢我的研究生导师王丽萍教授。在此次论文撰写的过程中，无论是在选题、设计、数据收集以及最后的成文定稿方面，您都倾注了大量的心血和汗水，学生感激不尽。您那渊博的专业知识，踏实肯干的敬业精神，精益求精的工作作风对我影响深远。而您那高尚的师德、开阔的胸怀更使我终生仰望！
同时，我也要衷心的感谢吉林大学生命科学学院的全体老师在实验期间对我的支持、鼓励和帮助。
感谢我的同门们，因为你们的无私帮助使我的实验能够顺利圆满的完成。
感谢我的家人、朋友一直以来对我的理解和陪伴。
最后，我要向在百忙中抽出宝贵时间来对本文进行评审并提出意见的各位专家学者表示衷心地感谢！