林涧 1，2，熊向华 1，葛欣 1，汪建华 1，苏昕 2，张惟材 1 1. 军事医学科学院 生物工程研究所 北京 100071；2. 沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016［摘要］ 目的：太岁是自然界中一种组成及分类尚不明确的生物体。采用分子生物学方法对 2 种不同来源地的太岁样品进行菌种分离培养和分子鉴定。方法：太岁表面经 75%乙醇消毒处理后，用麦芽汁培养基分离可培养菌株，提取太岁及分离菌株基因组 DNA，以之为模板，用 16S rDNA、18S rDNA 和 ITS 通用引物进行 PCR 扩增，扩增片段连入pMD18T 载体并测序，通过序列比对对太岁菌种组成进行初步鉴定。结果：从太岁 1 号样品中分离到假丝酵母（Can⁃dida）和粘质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），从太岁 2 号样品中分离到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和粘质红酵母。结论：2 种来源不同的太岁样品中均存在可培养的粘质红酵母。 ［关键词］ 太岁；生物多样性；培养；分子鉴定［中图分类号］ Q78 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009-0002（2013）06-0825-03Isolation and Identification of Microbial Strains in Two DifferentTaisui SamplesLIN Jian1,2, XIONG Xiang-Hua1, GE Xin1, WANG Jian-Hua1, SU Xin2, ZHANG Wei-Cai1* 1. Beijng Institute of Biotechnology, Beijing 100071; 2. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016; China*Corresponding author, E-mail: ammsmelab@126.com［Abstract］ Objective: Taisui is an organism with undefined classification existed in nature. The object of thisstudy was to isolate and molecular identity strains in two Taisui samples obtained from different source by molecu⁃lar method. Methods: After washing with 75% ethanol for about 10 s, the Taisui samples were inoculated intomalt wort medium to obtain the cultured strains. Genomic DNA of Taisui samples were isolated and used as thetemplate to amplify 16S rDNA, 18S rDNA and ITS by PCR. The PCR fragments were then ligated into pMD18Tand sequenced respectively. Strain identification was performed by sequence alignment against NCBI GenBank. Re⁃sults: Candida and Rhodotorula mucilaginosa were found in No.1 sample while Agrobacterium tumefaciens and R.mucilaginosa were found in No.2 sample. Conclusion: Rhodotorula mucilaginosa was found in these two Taisuisamples from different source.[Key words] Taisui; microbial diversity; culture; molecule identify

太岁又称肉灵芝，是一种未知的生命体。有研究称肉灵芝在调节免疫、恶性肿瘤等疑难杂症的治疗方面具有明显效果，因此受到社会各界的广泛关注。然而，关于太岁的本质及药理作用目前还存在较大争议。明代李时珍在《本草纲目》中对其有记载，并列举了几种与其相关的药方，但目前其药用价值并没有得到有效的科学考证。本实验室收集了10 种来自不同地区的太岁样品，我们重点对其中的2 个样品进行了分子生物学及分离菌株的鉴定，以期对太岁的生物学本质及其微生物组成有初步的认识，并希望从中得到有药用价值的菌株及活性成分。

1 材料与方法1.1 材料太岁样品 1 发现于新疆伊犁，由中央电视台走近科学栏目组转赠；太岁样品 2 由北京大兴区刘志军先生惠赠。大肠杆菌 DH5α感受态、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；载体 pMD18T 购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA markers、Hifi Taq DNA 聚合酶、dNTP 购自北京全式金生物技术有限公司；麦芽汁培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。 1.2 太岁样品的菌种分离1.2.1 太岁样品的表面消毒[1-2] 将切好的块状太岁样品用自来水冲洗 10 min，然后用 75%的酒精浸润10 s，再用 10 mL 无菌水反复冲洗若干遍，回收最后一次冲洗液，取适量涂布至平板培养基，以检测表面消毒效果。 1.2.2 太岁样品中菌株的分离 用灭菌的解剖刀将表面消毒完全的太岁样品切割成约 1 cm×1 cm 的小块，将切好的样品放入灭菌的研钵中，用研磨棒将样品磨碎，向其中加入无菌生理盐水 150 μL，将上清全部吸出，涂布于无抗麦芽汁平板，30℃恒温培养箱倒置培养 3 d。 1.3 太岁及分离菌株的鉴定1.3.1 样品总 DNA 提取 将太岁样品切成小块状，在无菌条件下磨碎，100℃煮沸 10 min，使其基因组完全释放，以此为模板进行 PCR 反应。 1.3.2 16S rDNA、18S rDNA、ITS 序 列 的 扩 增 引 物（表 1）由北京六合华大生物技术有限公司合成。PCR 扩增体系：10×缓冲液 5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各 2 μL，模板 1 μL，Taq 酶 1 μL，加 ddH2O 至50 μL。16S rDNA PCR 扩 增 条 件 ：95℃ 10 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30 个 循 环 ；72℃10 min。18S rDNA 和 ITS 扩增条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，30 个 循 环 ；72℃10 min。 1.3.3 太 岁 样 品 及 其 分 离 菌 株 的 16S rDNA、18SrDNA、ITS 测序 将 PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，将回收产物与 pMD18T 载体连接，16℃过夜，转入大肠杆菌 DH5α感受态，涂布X-Gal 平板，37℃倒置培养 12 h 后挑取白斑培养，经菌液 PCR 鉴定阳性克隆，将阳性转化子测序（北京六合华大基因科技股份公司完成），将测得的基因序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对，确定与所得菌株同源性最高的种属。

2 结果2.1 菌种的分离从太岁 1 号样品中分离得到 6 株可培养的单菌落 ，经 菌 落 形 态 观 察 ，确 定 为 3 种 微 生 物 ，编 号 为T1-1、T1-2 和 T1-3。从太岁 2 号样品中分离得到可培养的单菌落 10 株，通过菌落形态观察，确定为 3 种微生物，编号为 T2-1、T2-2 和 T2-3。2.2 太岁样品及其分离菌株的分子生物学鉴定2.2.1 太岁样品的分子生物学鉴定 通过对太岁1、2 号样品的 16S rDNA、18S rDNA、ITS 通用引物扩增序列测序，将所得序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对，结果表明太岁 1 号样品中包含 葡 萄 球 菌 属（Staphylococcus）、白 色 侧 齿 霉 菌（Engyodontium album）、假丝酵母属（Candida），太岁2 号样品中包含粘质红酵母（Rhodotorula mucilagi⁃nosa）、南极真菌（Antarctic fungal）、锁掷酵母属（Spo⁃ridiobolales）。2.2.2 太岁分离菌株的分子生物学鉴定 对太岁中分离到的菌株的 16S rDNA、18S rDNA、ITS 序列测序，将所得序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对，表明太岁 1 号样品中分离到的 T1-1 菌 株属于假丝酵母属，T1-2 和 T1-3 为粘质红酵母；太 岁 2 号样品中分离到的 T2-1 和 T2-2 为根癌农杆菌， T2-3 为粘质红酵母。在 2 个太岁样品的分离菌株中都发现了粘质红酵母，且太岁 2 号样品比对结果也表明其中存在粘质红酵母。 2.2.3 太 岁 中 分 离 的 3 株 粘 质 红 酵 母 初 步 研 究Blast 结果表明太岁 1、2 号样品中均分离到粘质红酵母。根据 Blast 结果以及对 3 株菌株的形态观察，发现这 3 株菌无论是在序列还是形态上均存在很大差异（表 2，图 1）。

讨论太岁是自然界中存在的一种身份未明的生命体，目前对于太岁的身份主要有以下几种观点：一种说法认为太岁是一种特大型罕见的黏菌复合体，另一种说法认为太岁主要由粘细菌构成，还有一种说法是太岁为一种特殊的高等真菌，另有人提出太岁并非黏菌群复合体。我们试图从微生物学角度研究太岁的菌种组成，希望能分离培养到样品中的优势菌株，对太岁的生物多样性有一个初步的了解。我们采用传统的菌种分离方法从 2 个太岁样品中各分离得到 3 种形态不同的菌株，通过分子生物学技术对 2 个太岁样品及分离菌株的 16S rDNA、18S rDNA、ITS 序列进行扩增，将所得序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对，发现从太岁 1 号样品中分离到 2 株粘质红酵母和 1 株假丝酵母属的菌株，从 2 号样品中分离到 2 株根癌农杆菌和 1 株粘质红酵母。在 1 号和 2 号样品中均分离到粘质红酵母，初步断定粘质红酵母是太岁可能的优势微生物类群之一。这对未来太岁身份及组成的研究有所帮助。由 于 条 件 所 限 ，本 研 究 还 存 在 很 多 局 限 和 不足。首先太岁样品的数量较少，提供太岁样品的收藏者对太岁的天然来源没有明确记载，有待大量收集样品，并确定其最初产地，以便分析样品中微生物种群组成与地域之间的关系。有些从形态上看似比较老龄，组织体质地比较致密的太岁样品，往往组织体的微生物形态不清晰，较难分离到存活的微生物，可能其中大部分微生物已死亡。其次，没有一个合适 的 基 因 组 提 取 方 法 来 保 证 回 收 到 所 有 的 DNA。PCR 的引物也是影响实验结果的一个重要方面，有文献报道[5]在引物设计方面存在的一些问题导致引物扩增具有一定的偏向性，经多轮扩增后会产生很多误差，从而导致实验结果的偏差[6-7]。

志谢：央视科技频道耿卓娅女士、太岁收藏者朱跃峰、刘志军、才彦良提供了太岁样品，特此致谢！参考文献[1] 宋素琴, 欧提库尔·玛合木提, 张志东, 等. 新疆胀果甘草内生菌的分离和鉴定[J]. 微生物学通报, 2007,34(5):867-871. [2] 周涛, 肖亚中, 李妍妍, 等. 茜草内生菌的分离鉴定及其抗菌活性物质研究[J]. 生物学杂志, 2007,24(2):9-12. [3] 何毅婷, 杨汝德, 张广, 等. 以 18S rDNA 序列鉴定一株产纤维素酶真菌[J]. 现代食品科技, 2008,24(7):638-640. [4] 戴璐, 董兆麟．“大型黏菌复合体”黏菌和真菌多样性的初步研究[D]. 西安: 西北大学生命科学院, 2007. [5] Smit E, Leeglang P, Glandorf B, et al. Analysis of fungal di⁃versity in the wheat rhizosphere by sequencing of clonedPCR-amplified genes encoding 18S rRNA and temperaturegradient gel electrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 1999,65:2614-2621. [6] Zheng D, Alm E W, Stahl D A, et al. Characterization of uni⁃versal small-subunit rRNA hybridization probes for quantita⁃tive molecular microbial ecology studies[J]. Appl Environ Mi⁃crobiol, 1996,62:4504-4513. [7] Suzuki M T, Giovannoni S J. Bias caused by template anneal⁃ing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes byPCR[J].App