佟嘉辉1,2，熊向华2，汪建华2，徐威1，张惟材2 1. 沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2. 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071［摘要］ 目的：太岁是自然界中一种未知生命体，本实验对 2例来源地不同的太岁样品进行菌株分离培养与鉴定。方法：太岁经表面消毒后无菌研磨，采用多种培养基涂板以分离可培养菌株，并进行16S rDNA、18S rDNA序列PCR扩增、测序及 Blast 比对。结果：从 2 例太岁样本中分别获得 4 株相似菌株，经鉴定，分离菌株 TS-1 为荧光假单胞菌（Pseudomonas flulorescens），TS-2 为地中海短波单胞菌（Brevundimonas mediterranea），TS-3 为红串红球菌（Rhodococ⁃cus erythropolis），TS-4为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）。结论：2例来源不同的太岁中均含有上述4种菌株，在生物学组成中具有一定的共性，为研究太岁的形成提供了新的思路。 ［关键词］ 太岁；分离培养；多样性；分子鉴定［中图分类号］ Q939 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009-0002（2018）02-0238-05Preliminary Study of Strains Isolated from Different“Taisui”SamplesTONG Jia-Hui1,2, XIONG Xiang-Hua2, WANG Jian-Hua2, XU Wei1*, ZHANG Wei-Cai2* 1. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016; 2. Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071; China*Co-corresponding authors, XU Wei, E-mail: shxuwei8720@163.com; ZHANG Wei-Cai, E-mail: drzhangweicai@163.com［Abstract］ Objective: "Taisui" is an undefined organism existed in nature. In this experiment, molecular biologi⁃cal identification and chemical analysis were carried out with strains isolated from different Taisui samples. Meth⁃ods: A variety of culturemedium was used to isolate and identifty the cultured strains. 16S rDNA, 18S rDNAwere amplified by PCR from crude DNA. The PCR fragments were then ligated into pMD18T and sequenced.Strain identification was performed by sequence alignment against NCBI GenBank. Results: Strain TS-1 was identi⁃fied as Pseudomonas fuorescen, TS-2 as Brevundimonas mediterranea, TS-3 as Rhodococcus erythropolis, TS-4 asSphingomonas sp. Conclusion: Some biological uniformity found in this two Taisui samples from different source.［Key words］ Taisui; isolation and culture; diversity; molecular identification

太岁也称肉芝。明代李时珍著《本草纲目》[1]中对其描述为：“肉芝状如肉，附于大石，头尾具有，乃生物也。赤者如珊瑚、白者如截肪、黑者如泽漆、青者如翠羽、黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也。”太岁样品多发现于土层中[2]，形如肉体，体型较大，表面光滑湿润，颜色多样，至今生物学界对其归类仍未给出明确答案。郑科研等[3]通过研究太岁样本的化学组成，推测其主体为聚乙烯醇，同时含有少量多糖及各种杂菌；朱春玉[4]等则测定了太岁中核酸、多糖、蛋白质等各生物体组成要素含量；西北大学戴璐[5]在对太岁样本的衍生体进行菌分离时共分离得到 2 种黏菌和 18 种真菌；王欣[6]从上述同一样本中分离得到 35 种细菌和 1 种黏细菌，其优势菌群属β-变性菌纲伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）；林涧等[7]从 2 例太岁样品中分离得到假丝酵母（Candida）和黏质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。本实验室收集了10 余例来自不同地区的太岁样本，着重对其中 2例样本的分离菌株进行分子生物学鉴定及分析，以期获得对太岁样品的生物学本质及其组成的初步认识。 1 材料与方法1.1 材料黄 色 太 岁（编 号 YF142）、白 色 太 岁（编 号ZWG0525）样品由本实验室保存；大肠杆菌 DH5α感受态、三氟乙酸（TFA）、7 种单糖标准品［葡萄糖（Glc）、甘 露 糖（Man）、半 乳 糖（Gal）、鼠 李 糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）］、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；pMD18T 载体购自 宝 生 物 工 程（大 连）有 限 公 司 ；DNA markers、Hifi Taq DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）购自生工生物公司；甲醇、磷酸、葡萄糖等试剂购自国药集团化学试剂有限公司；引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。Olympus BX-51 显 微 镜（WH 10×/22，100×/1.35 oil Iris）；Waters 600 高效液相色谱仪；Wa⁃ters Xbridge-C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱。 1.2 太岁样品预处理太岁样品表面消毒[8]。于超净台中切取块状太岁样品，用 75%酒精浸润 12 min 后用无菌水反复冲洗振荡若干次，回收最后一次冲洗液，取适量涂布于培养基平板上，30℃恒温培养以检测消毒效果。 1.3 太岁样品的菌分离及其分子生物学鉴定1.3.1 太岁样品分离菌的获取 采用林涧等[7]所述菌株分离法获取分离菌株，涂布于真菌培养基平板上（包括无抗及卡那霉素抗性 YPD 培养基、无抗及卡那霉素抗性麦芽汁培养基、虎红培养基及沙氏培养基），30℃恒温倒置培养 3 d，挑取单菌落平板划线培养。 1.3.2 太 岁 样 品 分 离 菌 16S rDNA、18S rDNA、ITS、NS 序列测定 50 μL 反应体系[7]，以 1 μL 提取的太岁样品总 DNA 为模板。16S rDNA PCR 扩增条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，50℃退火 30 s，72℃ 延 伸 90 s，循 环 30 次 ；72℃ 10 min；ITS 和18S rDNA 扩 增 条 件 ：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸 90 s，循 环 30 次 ；72℃10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒切胶回收目的基因后，一部分直接进行测序，一部分连接 pMD18T 载体，选取阳性克隆后进行测序。将基因序列与 GenBank 数据库进行Blast 比对，确定分离菌株的分类位置。 1.4 太岁样品分离菌多糖组成分析1.4.1 鞘氨醇单胞菌属发酵多糖分离 YPD 培养基于 30℃发酵培养 72 h 后，沸水浴溶解发酵液，12 000 r/min 离心 10 min 提取上清液，加入 2 倍量的 95%乙醇，4℃过夜醇沉，12 000 r/min 离心10 min 得到分泌的胞外多糖。 1.4.2 多糖样品水解 取 1 mL 提取的多糖样品置于具塞试管中，加入 2 mol/L TFA 2 mL，涡旋混匀，110℃水解 8 h，取出冷却至室温，12 000 r/min 离心 5 min，取上清，用 0.2 mol/L NaOH 溶液调 pH 值至 7，将水解液定容至 10 mL。 1.4.3 衍生化 准确称取上述 7 种单糖标准品，配制 100 μg/mL 单糖标准品溶液及混糖溶液（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖终浓度为 50 μg/mL，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖终浓度为5 μg/mL 的溶液）；取各单糖标准液、混合糖标准液和样品溶液 100 μL 置于不同试管中，依次加入 50 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液和 50 μL 0.2mol/L NaOH 溶 液 ，涡 旋 混 匀 ，70℃ 水 浴 反 应 40min，冷却至室温，加入 100 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和，用 400 μL 氯仿萃取，涡旋 4 min 混匀，4500 r/min 离心 5 min，取上层水相，重复 3 次，上层水相经滤器过滤混匀，待用，20 μL 进样分析。

1.4.4 HPLC 分析条件 Waters Xbridge-C18 柱，标准液进样量 20 μL，样品进样量 50 μL，柱温25℃，检测波长 250 nm。流动相 A 为 15%乙腈磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH6.9），流动相 B 为 40%乙腈磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH6.9）；梯度模式设置：时间为 0→10→30→40 min 时，相应浓度梯度为 0%→10%→30%→0%流动相 B。 2 结果2.1 太岁样品的形态学观察编号 YF142 的黄色太岁样品外观为黄褐色肉质，有弹性，有条纹带，内部成束状并伴有少量白色硬结，表面光滑湿润；编号 ZWG0525 的白色太岁样品体型较大，外观为白色，有弹性，表面光滑湿润，有类似蕈菌类的伞盖和薄膜，切割时有韧性。见图 1。

2.2 对太岁样品中分离得到的 4 株共性菌的初步研究对 2 例太岁样品进行菌株分离，通过培养观察及 Blast 比对，结果表明 2 例太岁样品中均含有以下 4 种原核菌株：TS-1 号菌株为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），TS-2 号菌株为地中海短波单胞菌（Brevundimonas mediterranea）（其 16SrDNA 部 分 序 列 上 传 至 GenBank，序 列 号 为 MF668251，长度为 1331 bp），TS-3 号菌株为红串红球菌（Rhodococcus erythropolis），TS-4 号为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）菌株。见图 2、表 2。

2.3 鞘氨醇单胞菌属分离菌的初步研究文献调研表明，鞘氨醇单胞菌属在生物降解

方面具有优势，与太岁较为类似。同时，鞘氨醇单胞菌属可分泌胞外多糖，推测其可能与太岁的形成有关，因此着重对其进行研究。采用鞘氨醇单胞菌特异引物（732 F/982 R）[9]对提取的太岁总 DNA 进行 PCR 扩增，得到一条约 250 bp 的条带，测序结果表明在提取的太岁总 DNA 中存在鞘氨醇单胞菌基因，并非污染产生。采用 YPD 培养基培养 TS-4 分离菌，30℃发酵72 h 后形成黄色冻状物（图 3），沸水浴溶解发酵液后，12 000 r/min 离心 10 min 提取上清液，加入2 倍量的 95%乙醇于 4℃过夜醇沉，12 000 r/min离 心 10 min 得 到 分 泌 的 胞 外 多 糖（图 4），通 过HPLC 对其单糖组成进行分析。 2.4 HPLC 分析多糖的单糖组成混 糖 标 准 品 PMP 衍 生 后 进 样 梯 度 流 动 相HPLC 分离结果见图 5。鞘氨醇单胞菌属分离菌发酵多糖 PMP 衍生后进样梯度流动相 HPLC 分离结果见图 6，确认其由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖组成，经标准品峰面积定量后对样品进行分析，其相对摩尔比约为 6∶1∶3。

3 讨论太岁是自然界中存在的一种特殊的未知生命体，至今生物学界对其归类仍未给出明确答案。1992 年西北大学对首例太岁样本进行了分析鉴定，认为太岁是一种“特大型罕见黏菌复合体”，并获得一定认可。我们通过微生物学角度研究太岁样本的菌种组成，以期初步了解太岁的生物多样性。采用多种真菌分离培养基对上述 2例太岁样品进行菌分离时，从无抗性 YPD 及麦芽汁培养基平板中分离得到多株相同形态的不同菌株，测序鉴定结果均为细菌，并且 2 例太岁样品中均含有上述 4 株菌株。经文献调研，河北师范大学李亮等在 NCBI 提交的太岁浸液中的 29 例菌种信息，其中 10 例为短波单胞菌属，5 例为鞘氨醇单胞菌属，3 例为假单胞菌属，与我们的结果很相似。结合王朝江[10-11]通过构建 16S rDNA 文库分析太岁样品细菌多样性的结果，我们认为 2 例来源地不同的太岁之间可能在生物学组成上存在一定的相似性，也提示不同太岁间存在一定的生物共性。

我们发现上述 2 例太岁样品菌分离得到的菌株均为细菌，并未从中获得真菌，而在对其他较新鲜的太岁样品进行菌株分离时得到了 2 株酵母，经鉴定其中一株为汉逊德巴利酵母（Debaryo⁃myces hansenii），推测可能是某些太岁样品的组织层较厚不易破碎、真菌含量相对较低或不易在实验室条件下获得并培养、现有分离手段不完善或样品保存条件等原因所致。因此，获取新鲜的太岁样品，对于太岁的研究非常重要。

志 谢 ：江 苏 靖 江 太 岁 金 波 生 物 科 技 有 限 公司，上海收藏协会太岁传习所陈建平、张网根、朱跃峰、王莉莉为本研究提供了太岁样本，特此致谢！参考文献[1] 李时珍. 本草纲目[M]. 上海: 商务印书馆, 1954. [2] Wang Chaojiang, Wang Shiqing. A research of thefinding and distribution law of Taisui in modern Chi⁃na [J]. Agric Sci, 2015,6:407-414. [3] 郑科研, 董兆麟. 不明物体太岁的初步研究[J]. 西北大学学报, 2010,40(6):12-17. [4] 朱春玉, 白婷婷, 姜秋实, 等.“太岁”生物学组分的研究 [J]. 微生物学杂志, 2011,31(1):1-5. [5] 戴璐.“大型黏菌复合体”黏菌和真菌多样性的初步研究[D]. 西安: 西北大学, 2007. [6] 王欣.“大型粘菌复合体”细菌多样性及抑菌功能初步研究[D]. 西安: 西北大学, 2007. [7] 林涧, 熊向华, 葛欣, 等. 2种太岁样品中微生物的分离和鉴定[J]. 生物技术通讯, 2013,24(6):825-827. [8] 刘宏生, 朱春玉. 一种从“太岁”中提取基因组的方法[P]. 中国: 200910220112.7. 2009-11-24. [9] 周丽莎, 李慧, 张颖, 等. 石油污染土壤鞘氨醇单胞菌遗传多样性 16S rDNA-PCR-DGGE 分析[J]. 土壤学报,2011,48(4):804-812. [10] 王朝江. 16S rDNA 克隆文库方法分析太岁样品中细菌的多样性[J]. 微生物学杂志, 2017,37(3):95-99. [11] 王朝江, 王世清. 基于高通量测序技术对三种太岁样品细菌组成的分析[J]. 湖北农业科学, 2017,56(13):2543-2547.