王朝江

( 河北省农林科学院 遗传生理研究所，河北 石家庄 050051) 摘 要 通过构建 16S rDNA 克隆文库的方法，分析太岁样品中细菌的群落结构及多样性。太岁样品中的细菌归属于 4 个门 9 个目，优势类群依次是芽胞杆菌目( Bacillales，33． 01% ) 、柄杆菌目( Caulobacterales，32． 04% )和伯克霍尔德氏菌目( Burkholderiales，12． 62% ) ; 优势属为短波单胞菌属( Brevundimonas，30． 10% ) 、葡萄球菌属( Staphylococcus，29． 13% ) 和食酸菌属( Acidovorax，7． 77% ) 。并且其中的 5 个目中含有未培养的细菌，红杆菌目( Ｒhodobacterales) 、伯克霍尔德氏菌目和红环菌目( Ｒhodocyclales) 的11 个克隆子的细菌 16S rDNA 序列同源性低于 97% 。研究表明太岁样品中细菌多样性较丰富，且蕴藏着许多未知的微生物资源。关键词 16S rDNA; 克隆文库; 太岁; 细菌多样性中图分类号 Q938 文献标识码 A 文章编号 1005 － 7021( 2017) 03 － 0095 － 05 doi: 10． 3969 /j． issn． 1005 － 7021． 2017． 03． 015

Analysis of Bacterial Diversity by 16S rDNA Clone Library from Taisui Sample WANG Chao-jiang ( Inst． of Genetics ＆ Physiol． ，Hebei Acad． of Agric． ＆ Forestry Sci． ，Shijiazhuang 050051)

Abstract The bacterial community structure and diversity of Taisui sample were analyzed through the construction of 16S rDNA clone libraries． Bacteria in Taisui sample belonged to 4 phyla and 9 orders． The dominant orders of bacteria were Bacillales ( 33． 01% ) ，Caulobacterales ( 32． 04% ) and Burkholderiales ( 12． 62% ) ． The most dominant genus was Brevundimonas ( 30． 10% ) ，the secondary dominant genus was Staphylococcus ( 29． 13% ) ，followed by Aci- dovorax ( 7． 77% ) ． There were uncultured bacteria of 5 orders among them，and 11 clones from Ｒhodobacterales， Burkholderiales and Ｒhodocyclales of bacterial 16S rDNA sequence homology were less than 97% ． The results indica- ted that high bacterial diversity was found in Taisui，also there were many unknown microbial resources． Keywords 16S rDNA; clone library; Taisui; bacterial diversity

“太岁”又称“肉灵芝”，《本草纲目》中描述为“肉芝状如肉，乃生物也，白者如截肪，黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也”。太岁生活于土壤中，生命力极强，有研究称太岁在抑菌、调节免疫、恶性肿瘤等疑难杂症的治疗方面具有明显效果，因此受到社会各界的广泛关注。太岁特有的弹性、韧性和粘性，极易使人直觉上判定是一种生物体，但到目前为止生物学界却一直难以给出归属，比较流行的观点认为是“大型黏菌复合体”，但仍有人持太岁为非生命体的观点。戴璐［1］研究了渭河太岁衍生体中黏菌和真菌多样性，分离出 2 种黏菌和 18 种真菌; 王欣［2］研究了上述同一样本中细菌多样性，获得 35 株细菌和 1 株黏细菌，优势菌群为 β-变形菌纲伯克氏菌目( Burkholderiales) 的细菌; 林涧等［3］也开展了类似的工作; 郑科研等［4］通过研究渭河太岁化学组成，推测其是以聚乙烯醇为主，含少量多糖和各种杂菌的不明物体; 朱春玉等研究了太岁的营养组成，指出其含有核酸、蛋白质等基本生物体构成要素，倾向于支持太岁是生命体的观点［5］，但过低的核酸含量则不能确认其来源于太岁本身还是太岁中的杂菌。本文作者［6］在分析了中国现代太岁 228 次发现报道后，明确了太岁存在的客观性和研究的必要性。因 此，进一步分析各种太岁中微生物的多样性及其与太岁本体的关系，为认识太岁属性、揭示生命特征提供科学依据。

1 材料与方法

1． 1 材料

1． 1． 1 供试样品 太岁由北京电视台科教节目记者转赠，外观白色肌纤维状，手触有弹性，并略有粘性，发现地为吉林长春，笔者保藏编号 004。 1． 1． 2 试剂与仪器 Ezup 柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒、SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒， dNTP( 上海生工生物工程股份有限公司) ，pMD ○Ｒ 18-T Vector 连 接 试 剂 盒 ( Takara 公 司) ，Dream Taq-TM DNA Polymerase( MBI) 等; 3730XL 测序仪( Applied Biosystems) ，HC-2518Ｒ 冷冻高速离心机( BBI) ，PCＲ 扩增仪( Applied Biosystems) ，FＲ980凝胶成像仪( 上海复日科技仪器有限公司) ，TH2-C恒温摇床( 太仓市实验设备厂) 等。

1． 2 方法

1． 2． 1 总 DNA 提取 为减少外界杂菌的影响，测试取样切自有胶质层包裹的边缘紧密组织。切块用无菌水震荡洗涤 200 次，无菌滤纸吸干表面水分，切去暴露的表层，剩余部分用于 DNA 的提取。太岁切块组织匀浆机捣碎后，用 Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取总 DNA。 1． 2． 2 PCＲ 扩增 以提取的 DNA 为模板，采用16S rDNA 扩增通用引物 7F( CAGAGTTTGATCCT- GGCT) 和 1540Ｒ( AGGAGGTGATCCAGCCGCA) 进 行 PCＲ［7］。PCＲ 反应体系: 5 × Buffer( with Mg2 + ) 2． 5 μL，dNTP( 各 2． 5 mmol /L) 2 μL，7F( 10 μmol / L) 0． 5 μL，1540Ｒ( 10 μmol /L) 0． 5 μL，Taq DNA聚合酶 0． 2 μL，DNA 模板 0． 5 μL，加 ddH2O 至 25 μL。PCＲ 反应条件: 98 ℃ 预变性 3 min; 98 ℃ 变 性 25 s，55 ℃复性 25 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环; 72 ℃延伸 10 min。

1． 2． 3 16S rDNA 克隆、转化和文库的构建 将得到的 PCＲ 产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化后，与 pMD ○Ｒ 18-T 载体连接，转化到大肠埃希菌 DH5α，用 Amp-Xgal /IPTG 抗性筛选平板选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子构建 16SrDNA 克隆文库( 上海生工生物工程股份有限公司) 。 1． 2． 4 16S rDNA 克隆文库分析 测序结果用Mothur 软件剔除嵌合序列，划分操作单元( Opera- tional Taxonomic Unit，OTU) 。通过 Shannon-Wie- ner 多样性指数( H) ［8］及均匀度指数( E) 分析细菌的多样性。

H = － ∑s i = 1PilnPi   E = H / ln S

S 表示克隆文库中 OTU 总数，Pi 表示第 i 个 OTU 在克隆文库中所占比例。文库覆盖率( C) 计算公式: C = ( 1 － n1N ) × 100% 。

其中 N 为阳性克隆子总数; n1 为仅含单个克隆子的 OTU 数量［9］。

1． 2． 5 构建细菌 16S rDNA 系统发育树 测序结果利用 BLAST 软件( http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov /blast /Blast． Cgi) 与 GenBank 数据库中的序列进行比对分析，选取同源性最高且合格发表的 菌 株 序 列，利 用 MEGA5 软 件，采 用 邻 接 法( neighbor-joining method) 构建系统发育树，代表克隆文库序列提交 GenBank。

2 结果与分析

2． 1 总 DNA 提取和 PCＲ 扩增对太岁样品提取的总 DNA 进行电泳检测，条带大小为 2 000 bp 左右，DNA 片段完整，并用细菌 16S rDNA 的通用引物 7F 和 1540Ｒ 扩增 16S rDNA 片段，结果如图 1 所示。由图 1 可知，16S rDNA 片段约 1 500 bp。

2． 2 太岁样品 16S rDNA 文库的多样性随机挑取太岁 样 品 16S rDNA 克 隆 文 库 中103 个阳性克隆子，并进行测序( 序列长约为 800 bp) ，结果如表 2 所示。代表克隆文库序列提交GenBank，序列 登 录 号 为: KX579862 ～ KX579878 和 KX686139 ～ KX686143。103 个阳性克隆共分为 22 个 OTU，其中 9 个 OTU 只含有一个克隆子，计算覆盖率 C 值为 91% ，说明本研究检出的微生物在一定程度上可以反映样品的细菌群落结构。计算 Shannon-Wiener 多样性指数 H 为 2． 22，均匀度指数 E 为 0． 72，由此可看出太岁样品中细菌多样性较丰富且比较均一。

图 1 太岁样品细菌 16S rDNA 的 PCＲ 扩增产物Fig． 1 PCＲ amplification of the bacteria 16S rDNA from " Taisui"加粗的 500、1 000、3 000 分别表示 Marker 中相应条带大小为 500 bp、1 000 bp、3000 bp the size of stripes corresponded to bold Markers are 500 bp， 1 000 bp，3 000 bp

由序列比对结果可知，太岁样品中细菌种类丰富，22 个 OTU 共归属于 4 个门的 9 个目。其中变 形 菌 门 的 67 个克隆子所占比例最大( 65. 05% ) ，包含 6 个目: 柄杆菌目( Caulobactera- les) 有 33 个克隆子，所占比例为 32． 04% ; 伯克霍尔德氏菌目( Burkholderiales) 有 13 个克隆子，所占比例为 12． 62% ; 红环菌目( Ｒhodocyclales) 有 7 个克隆子，所占比例为 6． 80% ; 根瘤菌目( Ｒhizobia- les) 有 5 个克隆子，所占比例为 4． 85% ; 红杆菌目( Ｒhodobac-terales) 有 5 个 克 隆 子，所 占 比 例 为4. 85% ; 鞘氨醇单胞菌目( Sphingomonadales) 有4个克隆子，所占比例为 3． 88% 。厚壁菌门的 34 个克隆子都归属于芽胞杆菌目( Bacillales) ，所占比例为 33． 01% 。疣微菌门的疣微菌目( Verrucomi- crobiales) 和浮霉菌门的浮霉菌目 ( Planctomyce- tales) 都只有 1 个克隆子且为未培养细菌。由此可知，本研究太岁样品中最优势类群为芽胞杆菌目 ( 33. 01% ) ，次优势类群为柄杆菌目( 32. 04% ) ，然后是伯克霍尔德氏菌目( 12． 62% ) 。另外，本研究太岁样品 16S rDNA 克隆文库 22 个 OTU 中 OTU5 的 31 个克隆子为短波单胞菌属( Brevundimonas，30. 10% ) ，是最优势属; OTU21 的 30 个克隆子为葡萄球菌属( Staphylococ- cus，29. 13% ) ，是次优势属; 然后 OTU1 的 8 个克隆子为食酸菌属( Acidovorax，7． 77% ) ; 其他 OTU所占比例均小于 4% 。

由表 2 可知，构建的 16S rDNA 文库中的克隆子与 GenBank 数据库中已知细菌的 16S rDNA 序列相似性最高为 100% ，最低为 90% 。其中 92 个克隆子( 89． 32% ) 与已知序列相似性高于 97% ， 11 个克隆子( 10． 68% ) 与已知序列相似性低于97% 。本研究中 16S rDNA 克隆文库的 5 个目( 红杆菌目、伯克霍尔德氏菌目、红环菌目、疣微菌目、浮霉菌目) 中 22 个克隆子为未培养的细菌; 3 个 目( 红杆菌目、伯克霍尔德氏菌目、红环菌目) 中 11个克隆子与已知细菌的 16S rDNA 序列差异性较大，同源性最低的仅为 90%，这说明太岁样品中不仅含有丰富的已知细菌，还蕴藏着许多未知及未培养的细菌，有进一步深入研究和开发的价值。

2． 3 太岁样品中

16S rDNA 系统发育分析测序结果利用 BLAST 软件与 GenBank 数据库中的序列进行比对分析，选取同源性最高且合格发表的菌株序列，利用 MEGA5 软件，采用邻接法构建系统发育树，结果如图 2。由图 2 可知，太岁样品克隆文库有 22 个 OTU，其中 21 个 OTU 分别与变形菌门、厚壁菌门和疣微菌门的细菌聚集在一起，另有 OTU22 与浮霉菌门的未培养细菌聚集在一起，形成单独的一支，该结果与序列比对结果相一致。

3 讨 论

本研究太岁样品 16S rDNA 克隆文库的 103个阳性克隆子共得到 22 个 OTU 归属于 4 个门的9 个 目，其中优势类群依 次是芽胞杆菌目( 33. 01% ) 、柄杆菌目( 32. 04% ) 和伯克霍尔德氏菌目( 12. 62% ) 。其中5 个目的22 个克隆子为未培养的细菌，3 个目的 11 个克隆子细菌 16S rDNA序列同源性低于 97% ，这说明太岁样品中的细菌不仅有较丰富的多样性，而且蕴藏着许多未知的微生物资源，有待进一步深入研究。

本研究太岁样品中细菌的优势属为短波单胞菌属( 30. 10% ) 、葡萄球菌属( 29. 13% ) 和食酸菌属( 7. 77% ) 。短波单胞菌属的琼脂糖酶产生菌能将琼脂降解为琼脂寡糖，琼脂寡糖具有抗癌、抗氧化、抗病毒等生理活性，被广泛应用于医药领域［10］。这可能与太岁对一些疑难杂症有特殊的疗效密切相关。另外短波单胞菌属细菌还能降解木质纤维素［11］、有机磷农药［12］和原油［13］等物质。这个属的细菌多见于水体中，有研究表明东居延海［14］和北极海水［15］中都是短波单胞菌属为优势种群。食酸菌属含有多种降解菌，能降解苯酚及苯衍生物［16］、腐植酸［17］、喹啉［18］、聚羟基丁酸戊酸共聚酯( PHBV) ［19］和 β-环柠檬醛［20］等难降解物质。以上结果表明太岁样品中细菌优势种群具有降解多种环境物质的作用，这可能与太岁在土壤环境中的生长有关，但仍需进一步研究。而葡萄球菌属细菌在太岁中的作用尚不清楚。

王欣［2］对渭河太岁衍生体中细菌多样性分析表明其体内的优势细菌种群为伯克氏菌目，而本研究太岁样品的伯克霍尔德氏菌目不是最优势细菌类群，所占比例为 12. 62% ，芽胞杆菌目为本太岁样品的最优势类群。两个研究中优势菌群的不同可能与太岁样品不同、样品采集地及保藏处理方式不同有关。另外，林涧等［3］发现其太岁 1号样品包含葡萄球菌属、白色侧齿霉菌、假丝酵母属，本研究太岁样品中的细菌也包含了葡萄球菌属。综合分析发现生长在不同环境中的太岁，其体内的微生物类群及优势种群存在差异，而不同太岁的细菌组成是否存在一定规律及差异形成的机理等还有待大量的研究证明。

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